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產(chǎn)品貨號(hào)：CEB526Ge

適用生物：通用

實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)水平。將LPS 單克隆抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中同時(shí)加入生物素標(biāo)記的抗原和待測(cè)抗原(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本)，待測(cè)抗原與生物素標(biāo)記抗原對(duì)特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。溫育后經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合物，然后加入HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過溫育和徹底洗滌后加入底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。待測(cè)標(biāo)本濃度越高，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān)，而與樣品中待測(cè)物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。

預(yù)期應(yīng)用：本試劑盒運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA 法定量測(cè)定血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中LPS 含量。

操作步驟：

1、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔5 孔，依次加入50μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見試劑準(zhǔn)備2)?？瞻卓准?0μL(見試劑準(zhǔn)備第二步最后一管)，余孔加待測(cè)樣品50μL，然后立即每孔加檢測(cè)溶液A工作液50μL，輕輕振動(dòng)，混勻，注意不要有氣泡，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 溫育1 小時(shí)。
2、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復(fù)洗板3 次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。
3、每孔加檢測(cè)溶液B 工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 溫育30 分鐘。
4、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟2。
5、每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在15-25 分鐘，不要超過30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的后面3 孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止)。

6、每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。
7、在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(O.D.值)。

標(biāo)本的采集與保存：
1、血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2 小時(shí)或4oC 過夜，然后1000×g 離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2、血漿：用EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30 分鐘內(nèi)于2-8oC 1000×g 離心15 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預(yù)冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2） 可同時(shí)選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預(yù)冷PBS 進(jìn)行充分研磨，該過程需在冰上進(jìn)行（有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2 次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測(cè)。
4、細(xì)胞裂解液：
1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）；
2）將收集到的細(xì)胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融）：
i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂。
ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20oC 以下冰凍，室溫融解，反復(fù)3 次，使細(xì)胞溶脹破碎。
4）將標(biāo)本于2-8oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。
5、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g 離心20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng)：
1、以上標(biāo)本均需密封保存，4oC 保存應(yīng)小于1 周，-20oC 不應(yīng)超過1 個(gè)月，-80oC 不應(yīng)超過2 個(gè)月。
2、標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
3、標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。試劑準(zhǔn)備

計(jì)算：

本試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法，所以樣本中LPS 的含量與其顯色呈負(fù)相關(guān)，LPS 的含量越高，顯色越淺，含量越低，顯色越深。
用標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值作圖（五點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），O.D.值為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上（或使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.30）繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（最佳方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R2 值來定，以R2 值越趨近于1 為好）。根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

典型數(shù)據(jù)：

為了便于計(jì)算，盡管濃度為自變量而O.D.值為因變量，我們繪圖時(shí)仍采用標(biāo)準(zhǔn)品的O.D.值作為橫坐標(biāo)(X 軸)，取標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y 軸)。由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的O.D.值會(huì)有所差異。所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需要根據(jù)自已的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。