英 文 名：25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) ELISA Kit
中 文 名：25-羥基維生素D3(HVD3)ELISA試劑盒
貨 號(hào)：CEA915Ge
適用生物：通用
預(yù)期應(yīng)用: HVD3 ELISA試劑盒運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA 法定量測(cè)定血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中HVD3 含量。
試劑準(zhǔn)備:
1、使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC 溶解。
2、標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10 分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200ng/mL。準(zhǔn)備5 個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP 管，每個(gè)EP 管中加入600μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次三倍稀釋成200ng/mL, 66.67ng/mL, 22.22ng/mL, 7.41ng/mL, 2.47ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0ng/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
3、檢測(cè)溶液A 及檢測(cè)溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測(cè)稀釋液A 或B1:100 稀釋(如：10μL 檢測(cè)溶液A/990μL 檢測(cè)稀釋液A)，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(50μL/孔)，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2mL。
4、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30 倍稀釋。
5、底物溶液：請(qǐng)用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回TMB 瓶中。
注意：
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。
2、標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。
3、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A 工作液、檢測(cè)溶液B 工作液請(qǐng)使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆?；靹驎r(shí)要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確請(qǐng)使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量加液器。請(qǐng)依據(jù)所需的量精確配制，盡量不要微量配制(如吸取檢測(cè)溶液A 時(shí)，一次不要小于10μL)，以避免造成濃度誤差。
4、請(qǐng)勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A 工作液和檢測(cè)溶液B 工作液。
5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請(qǐng)先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶完全溶解再進(jìn)行配制。
6、試劑盒中部分試劑為儲(chǔ)存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過(guò)程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實(shí)驗(yàn)中所用耗材潔凈度差，可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至完全錯(cuò)誤，請(qǐng)使用雙蒸水。
操作步驟:
1、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔5 孔，依次加入50μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見(jiàn)試劑準(zhǔn)備2)?？瞻卓准?0μL(見(jiàn)試劑準(zhǔn)備第二步最后一管)，余孔加待測(cè)樣品50μL，然后立即每孔加檢測(cè)溶液A工作液50μL，輕輕振動(dòng)，混勻，注意不要有氣泡，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 溫育1 小時(shí)。
2、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復(fù)洗板3 次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。
3、每孔加檢測(cè)溶液B 工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 溫育30 分鐘。
4、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟2。
5、每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在15-25 分鐘，不要超過(guò)30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的后面3 孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止)。
6、每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。
7、在確保酶標(biāo)板底無(wú)水滴及孔內(nèi)無(wú)氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(O.D.值)。
實(shí)驗(yàn)原理:
25-羥基維生素D3（HVD3)ELISA試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)水平。將HVD3 單克隆抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中同時(shí)加入生物素標(biāo)記的HVD3 類似物和待測(cè)抗原(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本)，待測(cè)抗原與生物素標(biāo)記HVD3 類似物對(duì)特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。溫育后經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合物，然后加入HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)溫
育和徹底洗滌后加入底物TMB 顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。
待測(cè)標(biāo)本濃度越高，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān)，而與樣品中
待測(cè)物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。
計(jì) 算:
本試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法，所以樣本中HVD3 的含量與其顯色呈負(fù)相關(guān)，HVD3 的含量越高，顯色越淺，
含量越低，顯色越深。
用標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值作圖（五點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），O.D.值為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上（或使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.30）繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（最佳方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R2 值來(lái)定，以R2 值越趨近于1 為好）。根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
典型數(shù)據(jù):
為了便于計(jì)算，盡管濃度為自變量而O.D.值為因變量，我們繪圖時(shí)仍采用標(biāo)準(zhǔn)品的O.D.值作為橫坐標(biāo)(X 軸)，取標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y 軸)。由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的O.D.值會(huì)有所差異。所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需要根據(jù)自已的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
檢測(cè)范圍: 2.47ng/mL-200ng/mL
最低檢測(cè)限: 0.91ng/mL (此值為20 個(gè)空白樣品(即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液)測(cè)定的平均值減二倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的濃度。)
特異性:
本試劑盒用于檢測(cè)HVD3，經(jīng)檢測(cè)與其它相似物質(zhì)存在一定交叉反應(yīng)。
由于受到技術(shù)及樣本來(lái)源的限制，不可能完成對(duì)所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測(cè)，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測(cè)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。
回收率:
分別于定值血清及血漿樣本中加入一定量的HVD3（加標(biāo)樣品），重復(fù)測(cè)定并計(jì)算其均值，回收率為測(cè)定值與理論值的比率。
線 性:
在定值血清及血漿樣本內(nèi)加入適量的HVD3，并倍比稀釋成1:2，1:4，1:8，1:16 的待測(cè)樣本，線性范圍即為稀釋后樣本中HVD3 含量的測(cè)定值與理論值的比率。
精密度:
精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV 表示。CV(%) = SD/mean×100
批內(nèi)差：取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè),每份樣本連續(xù)測(cè)定20 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。
批間差：選取3 個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定8 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。
批內(nèi)差： CV<10%
批間差： CV<12%
穩(wěn)定性:
經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。
為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。
參考文獻(xiàn)：
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參考文獻(xiàn)
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Decreased serum LL-37 and vitamin D3 levels in atopic dermatitis: relationship between IL-31 and oncostatin M
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引用雜志
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Allergy & Clinical Immunology 閱讀[Wiley: source]
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